摘要：PCR实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段

 PCR实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。

而三级综合医院不具备核酸检测能力的少之又少，大多已经实现了PCR实验的基本要求，差别只在于开展项目略有不同，这项要求真正难以落实的主要问题是：二级医院/县医院建立PCR实验室不容易。

就新冠病毒核酸检测来说，RT-PCR是目前使用广泛和较准确的筛选和确认方法，大规模核酸检测，必然会引起相关机构单位着力建设规范的临床PCR实验室。但是，建立一个PCR实验室，其实就是在建设一个平台，考验的不仅仅是一个医疗机构的实验能力，也考验着整个医疗机构的整体能力。下面，笔者就为大家整理一下PCR实验室建设及日常管理方面的一些问题。

 

一、临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是什么？

实验室的平面布局、空调通风 系统设计、气流控制等都是围绕同一个核心问题进行——“避免污染”，任何级别的医院在建设PCR实验室时，均需要提前考量各个因素，以保证标本的全环节质量及实验室的生物安全。

1、建设要求。PCR实验室的建设需要设置标准的“四区”：试剂准备区、标本制备区、PCR扩增检测区和扩增产物检测区。每个独立实验区设置有缓冲区，各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，并降低扩增产物对人员和环境的污染。

2、人员要求。进入PCR实验室，需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训，并获取PCR上岗证。

3、检测风险。检测过程中，样本的开盖，核酸提取的震荡、离心都有可能产生气溶胶，有感染的风险。

4、防护要求。必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进行。

 

二、PCR实验的污染来源都有哪些？

1、样本间交叉污染：收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

2、实验试剂污染：主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0℃，但这个过程也充满污染风险。

3、扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是PCR反应中主要、常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

4、克隆质粒污染：作为阳性质控品的克隆质粒外溢。

 

三、防止实验污染都有哪些措施？

对于低流行地区，PCR检测人员经过严格培训上岗后，核酸污染的风险相对较小，但在疫区超负荷工作时，就可能会遇到核酸污染的问题，可通过以下措施降低污染机会：

1、正确佩戴手套：手套未紧密贴合拇指、食指和中指，在进行开盖操作时容易发生交叉污染。

2、正确使用生物安全柜：简单、整洁、避免通风口堵塞；操作前后紫外线照射，消毒剂随手可及；废液缸里有1/3体积的含氯消毒液，并且及时清理废液缸，保证废物不超过废液缸体积的2/3。

3、核酸提取仪去污染：每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。

4、重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30min。

5、PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。

6、实验室随手可及的消毒剂。

 

四、PCR实验室的空气流向管理与环境消毒？

前面提到，PCR实验室可分为试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物检测区四个区域，这四个区域在物理空间上必须完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。所以，临床基因扩增检验实验室的空气流向应按：试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区，应时刻防止扩增产物顺空气气流进入扩增前区域。可按照上述顺序区域空气压力递减的方式进行，也可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行方式实现。

临床基因扩增检验实验室的环境清洁：《临床基因扩增实验室工作规范》中有对物表清洁、消毒的要求，不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

（1）基本原则：由清洁区向污染区进行，洁具不可交叉。

（2）清洁消毒方向：准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区。

（3）清洁消毒范围：工作区域的物体表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒剂擦拭消毒，空气和工作台面可使用紫外线照射消毒，也可使用空间消毒器进行全环节消毒。不可使用紫外线消毒器及化学消毒进行有人状态下的消毒。PCR室内的消毒应防止扬尘（减少人员走动）、杀灭DNA或RNA的基因片段。可选择悬挂紫外线灯管进行空气消毒，试验前照射30-60分钟，实验结束照射30-60分钟，必要时延长照射时间（可照射一夜）。

（4）终末消毒：当出现实验室污染时，应按要求立即撤出相关人员，在无人情况下可使用化学消毒剂进行终末消毒，如熏蒸法：过氧乙酸1g/ m³加热熏蒸（湿度70-90%），密闭24小时；气溶胶喷雾：3%过氧化氢：20mL/m³气溶胶喷雾；5%过氧乙酸2.5mL/m³气溶胶喷雾（湿度20-40%）。

 

五、日常清洁消毒应该如何做？

1、每日工作前后，对工作区域表面、地面进行清洁并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清洁采用湿式、不扬尘的方式进行。

2、物品防尘存放。墙面定期清洁，有可见污染及时进行清洁消毒。配备移动紫外线消毒装置进行空气和物表的消毒。

3、生物安全柜的消毒：

（1）每天工作前：对生物安全柜的内表面进行消毒，包括工作台面和内壁使用消毒剂擦拭；

（2）工作结束：柜内物品全部消毒后移出。消毒剂擦拭台面四周、以及玻璃内侧灯部位；

（3）停用生物安全柜前：运行5min以净化内部空气；

（4）消毒剂应选择能够杀死生物安全柜里可能发生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒剂）。在使用漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还应用无菌水再次进行擦拭；

（5）终末消毒：需要进行终末消毒的时机。

 

六、试验完成后，物品及环境如何处理？

（1）做好废液及固废处理；

（2）实验室空间消毒：在室温，50-60%湿度条件下，使用过氧乙酸熏蒸2g/m³，过夜；或使用20g/l气溶胶喷雾，用量8g/m³；

（3）物体表面消毒液：0.55%含氯消毒剂，现用现配，24小时内使用。